|
Title
|
تمايز بين موتاسيون BRAF V600EوWild-type
با استفاده از تكنيك Allele-Specific PCRو
Non-Extendable Primer Blocker(NEPB)
|
|
Type
|
Thesis
|
|
Keywords
|
سلول هاي MCF-7 ، واكنش زنجيره اي پلي مراز در زمان واقعي، DNA آزاد سلولي
|
|
Abstract
|
مقدمه و هدف:جهش V600E شايع ترينجهش ژنBRAF است كه در سرطان هاي انساني يافت مي شود. با اين وجود، تمايز بين ژن هاي جهش يافته و وحشي براي تشخيص بيماري هايي مانند سرطان سينه يا تيروئيد و ارزيابي پاسخ به درمان مؤثر،حائز اهميت است. براي بيماران سرطاني، بيوپسي بافت يك روش استاندارد است كه براي مشخص كردن جهش هاي سرطاني و ميزان بدخيمي سرطان استفاده مي شود. دسترسي به بيوپسي بافت محدود است و اغلب همراه با يك روش تهاجمي است. با اين حال، بيوماركرهاي سرمي يك جايگزين اميدوار كننده براي بيوپسي بافت است. cfDNA قطعات آزاد رها شده از سلول هاي مختلف در پلاسما مي باشد كه مي تواند به عنوان يك بيوماركر غيرتهاجمي در تشخيص سرطان و بيماري هاي ژنتيكي مورد استفاده قرار گيرد. با توجه به پايين بودن سطح جهش در مقابل نوع وحشي، تفكيك آلل ها دشوار است. اين مطالعه با استفاده از روش Allele -Specific PCRوNon-Extendable Primer Blocker(NEPB)به منظور تمايز نوع وحشي از آلل جهش يافته BRAFV600Eطراحي شده است.
مواد و روش ها:از رده سلولي سرطان تيروئيد B-CPAP و رده سلولي سرطان سينهMCF-7به عنوان منبع كنترل جهش يافته و نوع وحشي استخراج DNAصورت گرفت. واكنش real-time PCRبا استفاده ازپرايمرهاي allele specific و پروب TaqManبراي شناسايي قطعه 100 جفت باز در ژنBRAFانجام شد. جهت جلوگيري از تكثير نوع وحشي و افزايش شناسايي جهش BRAF، بلاكر(NEPB) در مقادير مختلف به مخلوط واكنش اضافه گرديد. حساسيت و اختصاصيت تست با غلظت هاي مختلف DNA ژنوميك ارزيابي شد. به عنوان الگوي cfDNA، DNA از نمونه هاي پلاسماي جمع آوري شده از افراد نرمال، با چهار روش فنل كلروفرم، سديم يديد، THP و كيت تجاري Roche تخليص صورت گرفت.ميزان تشخيص پرايمرهاي نوع وحشي و جهش يافته با استفاده از روش real-time PCR در رقت هاي محصولات PCR ارزيابي شد.
نتايج: بلاكر(NEPB) قادر به جلوگيري از تكثير BRAFwild توسط پرايمرهايBRAFV600E به ميزان دو سيكل بود. با اين حال، اين روش قادر به جلوگيري از تكثير كامل نوع وحشي در حضور ژن هاي جهش يافته نمي باشد. براي غلبه بر اين مشكل دماي اتصال پرايمرها به 64 درجه سانتي گراد تنظيم گرديد. ميزان تشخيص جهش BRAFV600Eتوسط پرايمرهاي اختصاصي و پروب TaqMan با استفاده از واكنش real-time PCR در دماي اتصال بهينه شده 5/0 درصد از كل DNA بود. به عبارت ديگر،
|
|
Researchers
|
Maryam Askari (Student) , Seyed Javad Hosseini (Primary advisor) ,
|