سیدجواد حسینی

مقدمه و هدف:جهش V600E شایع ترینجهش ژنBRAF است که در سرطان های انسانی یافت می شود. با این وجود، تمایز بین ژن های جهش یافته و وحشی برای تشخیص بیماری هایی مانند سرطان سینه یا تیروئید و ارزیابی پاسخ به درمان مؤثر،حائز اهمیت است. برای بیماران سرطانی، بیوپسی بافت یک روش استاندارد است که برای مشخص کردن جهش های سرطانی و میزان بدخیمی سرطان استفاده می شود. دسترسی به بیوپسی بافت محدود است و اغلب همراه با یک روش تهاجمی است. با این حال، بیومارکرهای سرمی یک جایگزین امیدوار کننده برای بیوپسی بافت است. cfDNA قطعات آزاد رها شده از سلول های مختلف در پلاسما می باشد که می تواند به عنوان یک بیومارکر غیرتهاجمی در تشخیص سرطان و بیماری های ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد. با توجه به پایین بودن سطح جهش در مقابل نوع وحشی، تفکیک آلل ها دشوار است. این مطالعه با استفاده از روش Allele -Specific PCRوNon-Extendable Primer Blocker(NEPB)به منظور تمایز نوع وحشی از آلل جهش یافته BRAFV600Eطراحی شده است. مواد و روش ها:از رده سلولی سرطان تیروئید B-CPAP و رده سلولی سرطان سینهMCF-7به عنوان منبع کنترل جهش یافته و نوع وحشی استخراج DNAصورت گرفت. واکنش real-time PCRبا استفاده ازپرایمرهای allele specific و پروب TaqManبرای شناسایی قطعه 100 جفت باز در ژنBRAFانجام شد. جهت جلوگیری از تکثیر نوع وحشی و افزایش شناسایی جهش BRAF، بلاکر(NEPB) در مقادیر مختلف به مخلوط واکنش اضافه گردید. حساسیت و اختصاصیت تست با غلظت های مختلف DNA ژنومیک ارزیابی شد. به عنوان الگوی cfDNA، DNA از نمونه های پلاسمای جمع آوری شده از افراد نرمال، با چهار روش فنل کلروفرم، سدیم یدید، THP و کیت تجاری Roche تخلیص صورت گرفت.میزان تشخیص پرایمرهای نوع وحشی و جهش یافته با استفاده از روش real-time PCR در رقت های محصولات PCR ارزیابی شد. نتایج: بلاکر(NEPB) قادر به جلوگیری از تکثیر BRAFwild توسط پرایمرهایBRAFV600E به میزان دو سیکل بود. با این حال، این روش قادر به جلوگیری از تکثیر کامل نوع وحشی در حضور ژن های جهش یافته نمی باشد. برای غلبه بر این مشکل دمای اتصال پرایمرها به 64 درجه سانتی گراد تنظیم گردید. میزان تشخیص جهش BRAFV600Eتوسط پرایمرهای اختصاصی و پروب TaqMan با استفاده از واکنش real-time PCR در دمای اتصال بهینه شده 5/0 درصد از کل DNA بود. به عبارت دیگر،