|
Title
|
كلونينگ ژن هورمون رشد فيل ماهي درسازه لنتي ويروس و غير ويروسي و بيان در سلولهاي جنيني انسان
|
|
Type
|
Article
|
|
Keywords
|
Not Record
|
|
Abstract
|
يكي از مهمترين كاربردهاي مهندسي ژنتيك در تحقيقات آبزي پروري، افزايش ميزان رشد ماهيان پرورشي از طريق
انتقال ترنس ژن هاي هورمون رشد به آنهاست. اما پيش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز اين
ترنس ژن هاي مطلوب الزامي است. از اين رو هدف از اين تحقيق، ساخت لنتي ويروس هاي نوتركيب حاوي ژن
هورمون رشد ) (GHفيل ماهي Huso husoو بهره گيري از آنها براي انتقال سازه ژني به سلول هاي هدف، به منظور
توليد پروتئين نوتركيب هورمون رشد و آناليزهاي بياني است. در اين مطالعه، cDNAهورمون رشد فيل ماهي كه با
استفاده از RNAاستخراج شده از غده هيپوفيز سنتز شده بود، توسط تكنيك PCRتكثير شده و سپس اين قطعه
ژن پس از كلونينگ در وكتور پلاسميدي pTZ57R/Tبر اساس جايگاه هاي آنزيمي مشخص برش داده شده و نهايتاً
به بدنه ناقل لنتي ويروسي pNL-EGFP/CMV-WPREپيوند و ساب كلون گرديد. بدين گونه اين سازه قادر به
توليد تيترهاي بالايي از ويروس هاي نوتركيب بالغ و فعال است. طي ترانسفكشن همزمان ناقل نهايي (ناقل انتقال
)pLV-GH-IRES-EGFPبه همراه دو ناقل كمكي (ناقل بسته بندي ويروس pCD/NL- BH*???و ناقل غشائي
)LTR-Gبا ليپوفكتامين به درون رده سلولي جنيني انساني ،HEK-293Tلنتي ويروس هاي نوتركيب حاوي سازه
ژني مورد نظر توليد و با تكنيك RT-PCRتأييد شدند. از آنجاكه در ساختار اين وكتور ژن نشانگر ،EGFPبواسطه
قطعه IRESدر فرودست ژن GHقرار داده شده است، بيان ژن در مراحل ترانسفكشن و ترانسداكشن به سهولت
تحت نور فلورسنت پيگيري شد. با تيتراسيون اين لنتي ويروس هاي نوتركيب در اين رده سلولي و تغليظ سوپرناتانت
ويروسي با ستون هاي تخليص پروتئين ،Amiconاستوك غليظي از ويروس هاي نوتركيب بدست آمد، كه در حدود
(يك پنجم كل استوك) توانست در مرحله ترانسداكشن (آلوده سازي سلول هاي هدف با ويروس حامل ژن) تيترهاي
بالايي از ويروس هاي نوتركيب بالغ و فعال حامل ژن GHفيل ماهي را توليد نمايد. نهايتاً بيان پايدار پروتئين
هورمون رشد فيل ماهي به همراه پروتئين نشانگر EGFPتحت ميكروسكوپ فلورسنت در اين سلول ها آشكار شده و
اثبات بيان توسط آناليز RT-PCRدر سطح mRNAمحرز گرديد. نتايج اين تحقيق بيانگر اين است كه از لحاظ
ارزيابي روش انتقال ژن بواسطه ناقلين لنتي ويروسي، اين تكنيك از كارآيي بسيار بالايي برخوردار است و در جهت
بستر سازي در عرصه تخليص و انبوه سازي هورمون رشد نوتر
|
|
Researchers
|
ُAhmad qasemei (Fifth researcher)
|