|
عنوان
|
کلونینگ ژن هورمون رشد فیل ماهی درسازه لنتی ویروس و غیر ویروسی و بیان در سلولهای جنینی انسان
|
|
نوع پژوهش
|
مقالات در نشریات
|
|
کلیدواژه‌ها
|
ثبت نشده‌است!
|
|
چکیده
|
یکی از مهمترین کاربردهای مهندسی ژنتیک در تحقیقات آبزی پروری، افزایش میزان رشد ماهیان پرورشی از طریق
انتقال ترنس ژن های هورمون رشد به آنهاست. اما پیش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز این
ترنس ژن های مطلوب الزامی است. از این رو هدف از این تحقیق، ساخت لنتی ویروس های نوترکیب حاوی ژن
هورمون رشد ) (GHفیل ماهی Huso husoو بهره گیری از آنها برای انتقال سازه ژنی به سلول های هدف، به منظور
تولید پروتئین نوترکیب هورمون رشد و آنالیزهای بیانی است. در این مطالعه، cDNAهورمون رشد فیل ماهی که با
استفاده از RNAاستخراج شده از غده هیپوفیز سنتز شده بود، توسط تکنیک PCRتکثیر شده و سپس این قطعه
ژن پس از کلونینگ در وکتور پلاسمیدی pTZ57R/Tبر اساس جایگاه های آنزیمی مشخص برش داده شده و نهایتاً
به بدنه ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV-WPREپیوند و ساب کلون گردید. بدین گونه این سازه قادر به
تولید تیترهای بالایی از ویروس های نوترکیب بالغ و فعال است. طی ترانسفکشن همزمان ناقل نهایی (ناقل انتقال
)pLV-GH-IRES-EGFPبه همراه دو ناقل کمکی (ناقل بسته بندی ویروس pCD/NL- BH*???و ناقل غشائی
)LTR-Gبا لیپوفکتامین به درون رده سلولی جنینی انسانی ،HEK-293Tلنتی ویروس های نوترکیب حاوی سازه
ژنی مورد نظر تولید و با تکنیک RT-PCRتأیید شدند. از آنجاکه در ساختار این وکتور ژن نشانگر ،EGFPبواسطه
قطعه IRESدر فرودست ژن GHقرار داده شده است، بیان ژن در مراحل ترانسفکشن و ترانسداکشن به سهولت
تحت نور فلورسنت پیگیری شد. با تیتراسیون این لنتی ویروس های نوترکیب در این رده سلولی و تغلیظ سوپرناتانت
ویروسی با ستون های تخلیص پروتئین ،Amiconاستوک غلیظی از ویروس های نوترکیب بدست آمد، که در حدود
(یک پنجم کل استوک) توانست در مرحله ترانسداکشن (آلوده سازی سلول های هدف با ویروس حامل ژن) تیترهای
بالایی از ویروس های نوترکیب بالغ و فعال حامل ژن GHفیل ماهی را تولید نماید. نهایتاً بیان پایدار پروتئین
هورمون رشد فیل ماهی به همراه پروتئین نشانگر EGFPتحت میکروسکوپ فلورسنت در این سلول ها آشکار شده و
اثبات بیان توسط آنالیز RT-PCRدر سطح mRNAمحرز گردید. نتایج این تحقیق بیانگر این است که از لحاظ
ارزیابی روش انتقال ژن بواسطه ناقلین لنتی ویروسی، این تکنیک از کارآیی بسیار بالایی برخوردار است و در جهت
بستر سازی در عرصه تخلیص و انبوه سازی هورمون رشد نوتر
|
|
پژوهشگران
|
سکینه مشجور (نفر اول)، حسین ذوالقرنین (نفر دوم)، موسی گردانه (نفر سوم)، محمدعلی سالاری (نفر چهارم)، احمد قاسمی (نفر پنجم)
|